生物负载：为什么小题大做？

生物负载测试的结果可以为制造商提供某一时间的“快照”，但问题是，在没有任何告警的情况下，情形就可能发生变化。制造商可能会遇到如下情况：看上去没有任何明显原因，生物负载测试的结果就超限了。由于微生物测试的性质，生物负载结果可能只能在医疗器械已消毒后才能给出。那么对制造商而言，假如大多数的灭菌方法都是采用一种过度杀伤的方式进行认证，同时还加入高剂量防腐剂，不合格的医疗设备生物负载结果究竟意味着什么？

生物负载测试确定的是医疗装置上的微生物负载，是原材料、贮存条件、生产环境和清洁度、制造工序以及人员等的诸多因素组合的微生物含量。如果生物负载结果保持一致性，并且在限定范围内，则表明任何可能导致微生物污染增加的方面都没有发生变化，特别是作为生物负载指标一大挑战的灭菌程序。为了符合标准《ISO 13485医疗器械-质量管理体系-用于法规（ISO 13485 Medical devices – Quality management systems – Requirements for regulatory purposes）》的要求，所有不符合项都必须予以追究，包括生物负载的结果。如果问题严重，或是不断出现生物负载异常，则很可能需要转换为CAPA（纠正措施和预防措施）。

调查医疗器械的生物负载异常存在不确定性，因为这个问题在本质上，是对已发生事件的一种被动反应。根本原因分析依赖于使用良好的问题解决工具。例如，石川图或鱼骨图，在图1中有一些建议的主题领域——利用的是一个多学科的组合。我们的想法是，尝试确定在处理过程中是否出现了导致生物负载异常的阶跃变化。也就是说，这是因为一个一次性的随机事件，还是由于一个固有的微生物交叉污染源？调查可能需要在进货乃至制造的所有阶段都要求做额外的测试，这通常是耗时且昂贵的。前期的风险分析，应该已经识别出需要控制的典型微生物的污染源；在处理过程中甚至一个小小的变化，都可能会引发大量的微生物污染影响。

Figure 1: Ishikawa (Fishbone) Diagram Principles

图1：石川（鱼骨）图的原则

对医疗装置上常见的微生物进行分类，是辨别潜在污染源的一个有用指标。例如，从处理的角度来看，葡萄球菌或微球菌表明存在人员污染，而革兰氏阴性微生物则表明存在水性污染。微生物存在的类型，可以判定灭菌过程的有效性。产品生物负载的微生物鉴定是一个基本要求，源于《ISO 11737-1:2006医疗器械灭菌--微生物学方法--第1部分:产品上微生物群落的测定（ISO 11737-1:2006 Sterilisation of medical devices – Microbiological methods – Part 1: Determination of a population of microorganisms on products.）》。用于表征医疗设备上存在的微生物类型的方法，列于表1。

前三种方法（染色特性、细胞形态和菌落形态）快速且廉价，在微生物实验室内简单易行，可以为常规生物负载测试提供足够的判定，鉴定微生物的所属类别。剩下的三个微生物表征方法（使用选择性培养、生化特性和基因序列数据）相对更费时，且需要专门的设备或介质，因此更加昂贵。但是，它们能够提供该微生物的物种或亚种水平的鉴定，提供更详细的分析。

基因序列数据依赖于进行比较的微生物物种数据库，以确认微生物鉴定。这种类型数据库的典型应用是用于医疗或食品工业。存在于医疗装置的生物负载，如果是非致病性或环境隔离种，则可能不会加入基因数据库，这种技术仅用于有价值的地方。所使用的具体方法，取决于微生物实验室的能力和最终医疗设备的性能，以及特定安全风险（例如，革兰氏阴性细菌在它们的死亡时，会释放出内毒素），或作为调查生物负载异常的辅助手段。

应通过前期的行动计划，找出最可能的根本原因，并进行验证和闭环处理

认证机构会希望看到一个彻底的调查，并建立适当的行动计划，控制生物负载异常问题，因为通常问题一旦发生，根因都很难确定。应通过前期的行动计划，找出最可能的根本原因，并进行验证和闭环处理。如果污染源被确定在供应商水平，这就具有挑战性，可能难以维持额外的生产控制。因为对于供应商而言，这么做没有什么利益价值。这就可能需采用其它方法控制原料的生物负载——例如，在制造之前，采取去污步骤。

高生物负载的最终问题离不开对灭菌的影响这个中心。医疗设备制造商使用的灭菌方法有许多。最常见的是：

 · 辐射（伽马，电子束，X射线）

· 环氧乙烷

· 蒸汽（包括空气压载水蒸汽）

· 气体等离子

所有的灭菌方法都需要进行验证，以验证指定负载配置的工艺参数，确保最低的无菌保证水平（10-6 SAL），依据《EN 556-1:2001 拟被认定为无菌的医疗设备的要求-第1部分:对最终灭菌设备的要求(EN 556-1:2001 Requirements for medical devices to be designated Sterile – part 1: Requirements for terminally sterilised medical device)》。对于医疗器械灭菌，伽马射线和环氧乙烷是主要的灭菌方法。对环氧乙烷和气体等离子体，验证灭菌流程最流行的方法是采用过度杀伤的方法，使用的是一种生物指示剂。这种生物指示剂对受调查的特定灭菌方法有一种已知的耐受性，例如，萎缩芽孢杆菌之于环氧乙烷灭菌。

蒸汽消毒验证也经常使用生物指示剂，但有时也通过简单的物理参数来实现的。对于辐照灭菌，一旦最低灭菌剂量已经确立，剂量审核必须能证明它持续符合最低灭菌剂量，详见《ISO11137-2:2013 医疗保健产品灭菌-辐照-第2部分：灭菌剂量的确定（ISO 11137-2:2013 Sterilisation of health care products – Radiation, Part 2: Establishing the sterilisation dose）》。

当正常医疗装置的生物负载发生增长时，灭菌耐受性微生物的数量和类型也可能会发生变化。任何变化都可能对灭菌验证的有效性产生影响。对于辐照灭菌，这种情况就可以观察到剂量审核不合格，但也不至于不需要做附加测试，就必须采用其它过度杀灭的灭菌方法。

图2：正常医疗装置生物负载级别的增加，意味着存在风险，即灭菌耐受性微生物的数量（或类型）可能也发生了变化

灭菌验证所需的附加测试，包括为灭菌过程和生物指示剂的耐受性评估医疗装置天然产生的生物负载，也被称为亚致死周期，即通过减少曝光时间来测试医疗装置，然后进行无菌试验。这一过程，是与灭菌验证中所使用的生物指示剂相结合进行的。该测试可以表明，生物负载中包含的灭菌耐受性微生物是否比在灭菌验证中使用的生物指示剂更多。只要保持生物指示剂的耐受性强于医疗装置的生物负载，灭菌验证就仍然有效。

如果环氧乙烷被用作最终的灭菌方法，则天然产生的耐受性生物负载测试必须在规定的时间间隔内完成，以确保生物指示剂的持续适用性，详见《ISO 11135-1:2007卫生保健品灭菌-环氧乙烷-第1部分:医疗设备灭菌过程的制定、确认和常规控制（ISO 11135-1:2007 Sterilisation of health care products – Ethylene oxide – Part 1: Requirements for development, validation and routine control of a sterilisation process or medical devices）》的要求。此外，灭菌的重新鉴定可能是必要的，因为产品的生物负载有所增加，需要证明其持续有效性。

通过辐射灭菌的医疗器械可能会遇到（较大的）更严重的后果，即发生剂量审核不合格，这取决于不合格的次数。它可能需要增大灭菌剂量连续灭菌，甚至也可能需要停止灭菌。特别值得关注的是，如果发生VDmax剂量审核不合格，则可能需要采用替代方法，重新建立灭菌剂量，详见ISO11137-2:2013标准。制造商可能无法使用VDmax方法重新建立剂量，而必须选择其他方法，例如方法1——这对制造商的财务和交货时间会产生影响。

监管部门将要求医疗设备制造商评估最终灭菌产品生物负载异常的影响。对于最终灭菌为辐射过程的医疗器械，已纳入了ISO11137-2:2013标准，10.4节：“...... 采用此剂量处理产品的结果不合格，则应考虑指定了SAL（无菌保证值）达标值的之前批次产品的灭菌剂量审核，并对其使用的适用性进行风险评估。”

对于医疗设备制造商，特别是当它减少了剂量审核的频率，可能会影响到大量的批次和设备类型，因此需要申辩，为什么产品没有因为一个潜在的灭菌问题而发起自愿召回。

 医疗设备制造商应该认识到生物负载测试的重要性，关系到医疗设备最终的整体安全性和性能，不能忽略它们的危险结果。制造商通过材料、生产、人员和环境实现微生物污染控制，生物负载的结果代表着他们的控制水平。生物负载异常调查有助于查明污染源，并确定改变工艺或材料的步骤，这些在初期可能考虑的较少。以不合适的频率执行生物负载测试，可能会导致生产供应问题，并在事情恶化时，使客户对医疗设备的信心产生无法弥补的影响。

                                                    （Clean room-technology）